نحوه کار کیت ویتامین دی و اساس آزمایش
در این مقاله طرز کار کیت ویتامین D به روش الایزا را بررسی می کنیم. کیت 25 هیدروکسی ویتامین دی به روش رقابتی و به کمک آنتی بادی مونوکلونال طراحی شده است. در این روش آزمایش در این روش چاهکها توسط آنتی بادی مونوکلونال که بر علیه مولکولی به نام 25 هیدروکسی ویتامین دی می باشد پوشش داده میشوند. استانداردها و نمونه های بیماران مختلف نیز با آنتی بادی پوشش داده شده در ته چاهک ها به همراه بافر استخراج جهت استخراج کردن ویتامین D از پروتئین متصل شونده آن مجاور میشوند. در ادامه نیز پس از پس از انکوباسیون ، 25 هیدروکسی ویتامین دی که به بیوتین متصل است به چاهک ها اضافه میگردد.
نکات مهم و نحوه استفاده از کیت ویتامین دی
1: قبل از شروع آزمایش، مواد و نمونه ها را به درجه حرارت اتاق برسانید.
2: برای هر نمونه از نوک سمپلر یکبارمصرف استفاده نمایید.
3: نحوه کار کیت ویتامین دی به شیوه ای که نتیجه دقیق داشته باشد بسیار به زمان وابسته است. به همین خاطر بهتر است کلیه مراحله آزمایش پشت سرهم و بدون توقف زمانی انجام شوند.
4: پس از اضافه کردن محلول متوقف کننده، جذب نوری چاهکها حداکثر تا نیم ساعت قابل قرائت میباشد.
5: زمان انکوباسیون مناسب، از مهمترین فاکتورها در کسب نتیجه مطلوب است. به همین خاطر پیشنهاد میشود که قبل از شروع آزمایش تمام مواد و محلول های مورد نیاز آماده باشند تا مراحل آزمایش سریع تر باشد.
6: برای کسب نتیجه بهتر، شستشوی چاهکها باید به صورت کامل صورت گیرد و آخرین قطرات پس از شستشو از چاهکها تخلیه شوند.
7: به دلایلی مشابه مورد پنجم، پیشنهاد میشود که حجم انجام تست محدود باشد و زمان ریختن نمونه ها بیش از 5 دقیقه طول نکشد.
8: محلول بافر واکنش که از ترکیب کردن هم حجم دو محلول Assay Buffer و Extraction Buffer به دست می آید، باید بلافاصله پس از افرودن نمونه ها تهیه شود و در نهایت ظرف 5 دقیقه به مصرف برسد.
در این مقاله طرز کار کیت ویتامین D به روش الایزا را توضیح دادیم. توجه فرمایید که طرز کار کیت ویتامین D به روش الایزا بسیار ساده است اما به زمان وابسته است. به همین خاطر قبل از شروع آزمایش نحوه کار آن را آموخته باشید.
مراحل کامل و طرز کار کیت ویتامین دی
1: تعداد چاهکهای مورد نظر را انتخاب نموده و سایر چاهکها را به همراه نمگیر درون کیسه مخصوص نگهداری پلیت قرار داده و درب آن را ببندید.
2: 20 میکرولیتر از هر استاندارد، سرم کنترل و نمونه را به داخل هر چاهک بریزید، پیشنهاد می گردد که از استانداردها و نمونه ها بصورت داپلیکیت استفاده شود بدین معنی که هر استاندارد و نمونه را در دو چاهک بریزید و در انتها از میانگین جذب نوری آنها برای محاسبه نتایج استفاده کنید، سپس 100 میکرولیتراز محلول واکنش را به داخل هر چاهک بریزید.
3: جهت تهیه محلول بافر واکنش می بایست به ازای هر چاهک به میزان 75 میکرولیتر از بافر استخراج را با 75 میکرولیتر محلول اسی بافر در لوله آزمایش بخوبی با هم مخلوط کنید.
4: پلیت را برای مدت 1 تا 2 دقیقه به آرامی تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط شوند و سپس درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد و در تاریکی انکوبه نمایید. عمل تکان دادن پلیت را تا مخلوط شدن کامل و یکنواخت شدن رنگ محتویات چاهک ها ادامه دهید.
5: پس از پایان انکوباسیون و بدون هر گونه شستشوی چاهکها مقدار 25 میکرولیتر از محلول کنژوگه 1 1 را به هر چاهک اضافه نمایید.
6: پلیت را برای مدت 1 تا دو دقیقه به آرامی تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط شوند و سپس درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در انکوباتور با درجه 37 سانتی گراد در تاریکی انکوبه نمایید. عمل تکان دادن پلیت را تا مخلوط شدن کامل و یکنواخت شدن رنگ محتویات چاهک ها ادامه دهید.
7: پس از پایان انکوباسیون و بدون هر گونه شستشوی چاهکها مقدار 25 میکرولیتر از محلول کنژوگه 2 را به هر چاهک اضافه نمایید.
8: پلیت را برای مدت 1 تا دو دقیقه به آرامی تکان دهید تا محتویات چاهکها خوب مخلوط شوند و سپس درب چاهکها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده و چاهکها را به مدت 30 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد و در تاریکی انکوبه نمایید. عمل تکان دادن پلیت را تا مخلوط شدن کامل و یکنواخت شدن رنگ محتویات چاهک ها ادامه دهید.
9: محتویات چاهکها را خالی کرده و چاهکها را 5 بار با محلول شستشوی آماده مصرف بشویید. (برای شستشو میتوان از سمپلر 8 کاناله استفاده نمود ولی باید مواظب بود که محلول شستشو از یک چاهک به چاهک دیگر وارد نشود زیرا می تواند موجب ایجاد خطا در نتیجه آزمایش گردد. در هر دفعه شستشو حدود 300 میکرولیتر محلول شستشو در هر چاهک ریخته و سپس چاهک ها را با وارونه کردن و تکاندن خالی نمایید و در انتهای عملیات شستشو چاهکها را در حالت وارونه و با ضربات ملایم بر روی یک پارچه یا کاغذ نمگیر بکوبید تا قطرات اضافی خارج شوند.
10: 100 میکرولیتر محلول رنگزا به هر چاهک اضافه نمایید.
11: چاهکها را به مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق و در تاریکی انکوبه نمایید.
12: با اضافه کردن 100 میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاهک ادامه واکنشهای آنزیمی را متوقف نمایید. برای سنجش جذب نوری هر چاهک از دستگاه الایزاریدر با فیلتر 450 نانومتر 450 استفاده نمایید. توصیه میشود از فیلتر 630 نانومتر 630 به عنوان فیلتر رفرانس استفاده گردد.ک
مطلب کاربردی و خوبی بود
خوشحالیم که مورد توجهتون قرار گرفته